胚と母体との会話ー着床機構の基礎研究から臨床応用ー
京都大学医学部婦人科学産科学教室
助教授 高倉 賢二 先生
（日本産科婦人科学会雑誌 第５３巻 弟８号）
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難治性不妊症に対する治療として急速に普及している体外受精胚移植（ＩＶＦ-ＥＴ）をみても，新鮮胚を用いた場合，採卵成功率（採卵総回数/治療周期総数）は９６．４％（33，206/34，450），胚移植成功率（胚移植回数/排卵回数）は８１．３％（26，996/33，206）と，ともに良好であり（日産婦報告，2000）１），卵巣刺激に伴う卵巣過剰刺激症候群など，種々の問題点を包含しているとはいえ，着床までの過程はほぼ克服できるいるといえる．その一方で，移植当たりの妊娠率は２２．６％にとどまっており（日産婦報告，2000）１），複数個の胚を移植していることを考えると，移植された胚の９０％以上は着床に至っていない現状である（高倉ら，1998）２）．しかも妊娠成績はここ１０年以上ほとんど改善されておらず，その原因はまさに着床率の低さにあると考えられる．ＩＶＦ-ＥＴの低調な妊娠成功率を改善するためには，着床率を向上させることが最も重要であり，これにより妊娠成績の改善のみならず，過剰な卵巣刺激に伴う多胎や卵巣過剰刺激症候群などのＩＶＦ-ＥＴに合併する危険も回避できる可能性がある．
このように着床機構の解明は臨床的にも大きな命題であるにもかかわらず，未解明の点が多い主要な理由のひとつは適当な着床モデルを用いてた実験系が確立していないことであろう．胚を扱う必要があるので，ヒトでの実験は倫理的に施行困難であり，われわれは発生学の領域で幅広く研究されているマウスを用いて，in vivoの検討だけでなく，in vitro着床モデルを開発し，「胚と母体との対話」に着目した着床機能に関する一連の基礎的な解析を行った．これにより，着床周辺期の胚と母体との間には緊密な双方向性の対話が存在し，特に，これまであまり注目されなかった胚から母体へのシグナルの存在が明らかとなった．この成果の臨床応用としてＩＶＦ-ＥＴにおける〝Two-step embryo transfer（２段階胚移植法）”を開発し，これまでに良好な妊娠成績を得ているので併せて紹介する．
これは卵管内に胚の存在するレシピエントと，通常の偽妊娠状態のレシピエントを作成して胚移植を行い，その着床率を比較して，胚の存在そのものが自己の着床に影響を与えるか否か検討したものであり，具体的方法論は以下の通りである．
①交配翌日に子宮卵管移行部で両側卵管結紮を行い卵管内に胚の存在するマウス（卵管結紮妊娠マウス），②偽妊娠マウス，③両側卵管結紮後交配を行ったマウス（卵管結紮非妊娠マウス），④両側卵管結紮後交配を行った偽妊娠マウス（卵管結紮偽妊娠マウス）の４群をレシピエントとして，Ｄａｙ４（膣栓確認日をＤａｙ１とする）の胚を子宮内膜内あるいは子宮腔内に移植し，４群のレシピエントにおける着床率（着床胚数/移植胚数）と子宮内妊娠率（妊娠個体数/移植固体数）を比較検討し，表１の結果を得た．すなわち，卵管内に胚が存在する場合（卵管結紮妊娠マウス）においては，存在しない場合に比べてｉｍplantation windowが前後に拡大した．また，各群のレシピエンドから得られた子宮内膜組織のＰＣＮＡ免疫染色により，卵管結紮妊娠マウスでは，それ以外のレシピエンドより間質細胞のＰＣＮＡ陽性率が著名に高く，卵管内の胚が子宮内膜に作用して胚受容能を促進することが明らかとなった．
すなわち，着床するまでの間，胚は積極的に母体に働きかけて，事故の着床に適した環境を整備していることが想定されるのである．また，卵管は配偶子や胚をただ輸送するだけでなく，着床に向けた胚からのシグナルを母体に伝える情報発信基地として重要な役割を果たしているともいえよう．これらの概念はこれまでほとんど着目されておらず，着床機構の解明に新たな視点を提供するものといえる．
| 卵管結紮妊娠マウス | 偽妊娠マウス | 卵管結紮非妊娠マウス | 卵管結紮偽妊娠マウス | ||||||
| 着床率 （％） |
妊娠率 （％） |
着床率 （％） |
妊娠率 （％） |
着床率 （％） |
妊娠率 （％） |
着床率 （％） |
妊娠率 （％） |
||
| 子宮内膜内移植 | Day 1 2 3 4 5 6 |
０．０ ２０．８ ７２．２ ５９．７ ２０．８ ９．７ |
０．０ ４１．７ ９１．７ １００．０ ５０．０ ２５．０ |
０．０ １８．３ ５５．０ ５０．０ ８．３ ０．０ |
０．０ ３５．０ ９０．０ ８５．０ ２５．０ ０．０ |
０．０ １８．１ ５６．９ ５０．０ ９．７ ０．０ |
０．０ ３３．３ ８３．３ ９１．７ ３３．３ ０．０ |
０．０ １６．７ ５２．５ ４５．８ ６．７ ０．０ |
０．０ ３０．０ ９０．０ ７５．０ ２５．０ ０．０ |
| 子宮腔内移植 | Day 1 2 3 4 5 6 |
０．０ １１．１ ５８．３ ５６．９ ２５．０ ８．３ |
０．０ １６．７ ８３．３ ７５．０ ４１．７ ２５．０ |
０．０ ０．０ ５１．７ ５０．８ ３．３ ０．０ |
０．０ ０．０ ８０．０ ７５．０ １０．０ ０．０ |
０．０ ０．０ ５４．２ ５４．２ ４．２ ０．０ |
０．０ ０．０ ７５．０ ６６．７ ４．２ ０．０ |
０．０ ０．０ ５２．５ ５３．３ ４．２ ０．０ |
０．０ ０．０ ８０．０ ７０．０ ５．０ ０．０ |
われわれはマウスの子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）のｉｎ vitro脱落膜化実験系を確立し７），さらに胚盤胞とＥＳＣの共培養によりin vitro着床モデルの作成を行い８），胚と子宮内膜の間の相互作用，すなわち，〝胚と母体との対話”の存在について検討した．すなわち，前述したin vivoにおける，胚依存性の子宮内膜における胚受容能誘導機構の存在をさらに実証するための実験を行った．
胚盤胞とＥＳＣとの共培養によるin vitro着床モデルで，胚がＥＳＣの脱落膜様変化を誘導することが明らかとなり（図１）８），卵管妊娠における卵管内膜の胚依存性形態変化と同様の現象が子宮内膜でも起こることが確認された．さらに，マウスＥＳＣのin vitro脱落膜化実験系において，Ｅ/Ｐ投与により形態的に脱落膜様変化が起こるだけでなく，ヒトと同様にＰＲＬ遺伝子発現が誘導されることを明らかにしたうえで，図２に示すような，①胚とＥＳＣが接着した条件，②胚とＥＳＣを離して液性成分のやりとりは存在する条件の二種の系で共培養し，ＥＳＣにおけるＰＲＬ遺伝子の発現を検討した．この結果，胚によりＥＳＣのＰＲＬ遺伝子発現が誘導され，これには胚がＥＳＣに直接触れる必要がなく，胚から分泌される液性成分により惹起されることが明らかとなった．ＰＲＬだけでなくd/tPRP（脱落膜/絨毛膜ＰＲＬ関連ペプチド）遺伝子についての検討でも同様の結果が得られた．
最近，ヒトにおいてはhCGがＥＳＣ脱落膜化の中心的役割をはたしているとの報告があり９）１０），ＥＳＣ脱落膜化誘導因子は胚から分泌されるhCGの可能性が想定された．しかし，われわれのヒトＥＳＣにおける検討では，hCGによって脱落膜化は誘起されず，脱落膜化の主要な因子はＰであることが明らかとなり，hCG脱落膜化説は否定的と考えられた１１）１２）．マウスにおいてはhCGに相当する物質は存在しないが，このＥＳＣ脱落膜化誘導因子，あるいは胚受容能誘導因子の同定は着床機構および脱落膜化機構の解明によって重要なものとなろう．
図１ 胚との共培養によるマウス子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）の形態変化
マウス子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）をエストラジオール（Ｅ２）０．１ｎＭ，プロゲステロン（Ｐ）１００ｎＭ添加あるいは非添加で培養し，９日目にＤａｙ４（膣栓確認日をＤａｙ１として）の胚との共培養を開始した．Ｅ２/Ｐ添加群では共培養７日目，２０日目のいずれにおいても，ＥＳＣの著名な脱落膜細胞様変化を認めた．非添加群においても共培養２０日目には脱落膜細胞様変化を認めた．
透過電顕写真．Ｂａｒｓ＝１μｍ．
図２ 子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）における胚との共培養によるＰＲＬ遺伝子発現（マウス）図に示す条件で，ＥＳＣと胚との共培養あるいはＥＳＣ単独培養を行い，ＥＳＣのＰＲＬ遺伝子発現を検討した．エストラジオール（Ｅ２）/プロゲステロン（Ｐ）添加群だけでなく，非添加群でも胚との共培養によりＰＲＬ遺伝子発現を認めた．胚とのＥＳＣが接触していなくても同様に，ＰＲＬ遺伝子発現を認めたことから，胚からの液性因子により誘導されたものと考えられた．
図３ 胚発育面積の推移（マウス）
図１説明で示した条件で，子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）と胚との共培養を行い，胚の発育面積を検討した．エストラジオール（Ｅ２）/プロゲステロン（Ｐ）添加によりＥＳＣに脱落膜様変化を誘導した群で，他群と比較して有意に胚の発育面積の増大が促進された．胚の単独培養群では，Ｅ２/Ｐの添加，非添加にかかわらず，共培養１２日目には胚が変性した．
＊＊は非添加群との間に有意差を認めた．
図４ 胚と子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）との共培養（マウス）
図１説明で示した条件で，子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）と胚との共培養を行い，胚の発育形態を検討した．エストラジオール（Ｅ２）/プロゲステロン（Ｐ）添加によりＥＳＣに脱落膜様変化を誘導した群では胚の輪郭が鮮明であったが，非添加群では不鮮明であり，胚とＥＳＣの境界が判然としなかった．位相差顕微鏡写真．Ｂａｒｓ＝０．６㎜．
胚盤胞とＥＳＣとの共培養によるin vitro着床モデルを用いて，ＥＳＣ脱落膜化の胚に及ばす作用をみると，Ｅ/Ｐ添加により脱落膜化を誘起した場合，Ｅ/Ｐ非添加群にくらべて胚の面積でみた胚発育は明らかに促進された（図３）．また，位相差顕微鏡で胚の形態を観察すると，Ｅ/Ｐ添加群では輪郭が不鮮明で辺縁が不整となり，脱落膜化により形態的なintegrityが保たれることが示唆された（図４）．さらに透過型電子顕微鏡を用いてトロホブラストとＥＳＣの境界部分を観察すると，Ｅ/Ｐ非添加群ではＥＳＣの細胞間にトロホブラストが入り込んでおり，あたかも浸潤しているような増殖様式を示した（図５）．Ｅ/Ｐ添加群では胚とＥＳＣの境界線がスムーズで，トロホブラストの浸潤像は認められなかった．このようにＥＳＣの脱落膜化により胚発育が促進されるだけでなく，トロホブラストの増殖も制御されることが明らかとなった８）．すなわち母体によりトロホブラストの発育が制御されていることが確認された．
図５ マウス子宮内膜間質細胞脱落膜化とトロホブラストの増殖様式
図１説明で示した条件で，子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）と胚との共培養を行い，胚の発育様式を検討した．エストラジオール（Ｅ２）/プロゲステロン（Ｐ）添加によりＥＳＣに脱落膜様変化を誘導した群ではトロホブラストはＥＳＣ細胞間には入り込まず，ＥＳＣとの境界が整然としていた．非添加群では，トロホブラストがあたかも浸潤するようにＥＳＣに入り込み，ＥＳＣとの境界は判然としなかった．
透過電顕写真．Ｂａｒｓ＝１．５μｍ．
ＩＶＦ-ＥＴ法で〝ｅｍｂｒｙｏ-ｐｒｉｍｉｎｇ”を応用した手法として考察したのが〝two-step embryo transfer”である．これは採卵２日後に〝ｅｍｂｒｙｏ-ｐｒｉｍｉｎｇ”を目的とした胚を２個移植し，５日後に本命ともいうべき着床を期待する胚盤胞を１個移植するという方法であり，倫理委員会の承認を経て１９９９年６月よりその臨床応用を開始している．図７にそのプロトコールを示した．採卵２日後（Ｄａｙ２）において２細胞期異常の胚を４個以上有することを適応基準としている．Ｄａｙ２において形態が最も良好な胚は２段階目の移植の候補とし，それについて良好な２個の胚をまずＤａｙ２に移植する．表２に従来法と比較したtwo-step embryo transferの成績を示す．Ｄａｙ２にのみ胚を移植する従来法に比較して症例当たりの妊娠率および胚当たりの着床率が有意に改善されている．
近年，胚盤胞移植がおこなわれるようになり，その利点として，①移植胚数を減らして多胎の発生を抑制する，②より良好な胚を選択することができる，③胚移植の時期をin vivoに近い条件で行える，④着床前遺伝子診断が行えるなどの可能性が指摘されている１３）．しかし一方で，①胚移植までに胚が変性してキャンセルになる率が高くなる，②女児より男児の出生が多くなる，③一卵性双生児の頻度が高い，④凍結できる胚が少なくなるなどの可能性も指摘されており，２００１年１月に米国生殖医学会は体外受精胚移植法の第一選択とはならないとする見解を表明している１３）．
胚盤胞移植において，さまざまな問題点が指摘される中で，two-step embryo transferとこれまで報告されている主な胚盤胞移植の成績を比較すると（表３），two-step embryo transferは臨床妊娠率は胚盤胞移植に匹敵し，多胎妊娠率は低い傾向がある．また，胚盤胞が得られない場合にもＤａｙ２に２個の胚を移植するので，結果的に治療周期そのもののキャンセル率は低くなるものと考えられる．今後の展開が期待される．
図６ 胚と母体との対話（模式図）
ヒトの発生弟１週（受精から約１週間）に受精卵は２細胞期→４細胞期→８細胞期→桑実胚を経て胚盤胞（胞胚）となり，子宮腔に到達し，着床に至る．すなわち，妊娠成立の約１週間前からヒトの発生は始まっている．排卵後約１２～２４時間で受精し，受精後約２４時間で２細胞期，受精後約３日で桑実胚，受精後約４～５日で桑実胚あるいは初期胚盤胞となって子宮腔に到達し，受精後約６日で着床が開始し，７～１２日に胚が子宮内膜に埋没して，着床が完成する．着床前の胚と母体との間には相互の対話が存在するものと考えられる．
| Day 2 ET a | Two-step ET b | |
| 移植周期数 平均採卵数 平均受精卵数 移植胚数 臨床妊娠数（％） 胚当たり着床率 多胎妊娠数（％） |
32 10.3 7.3 3 13 (40.6) 15.6 2 (15.4) |
75 10.0 6.6 3 50(66.7)＊ 28.0＊ 13(26.0) |
b Two-step embryo transferの症例
＊ p < 0.05
図７ 〝ｔwo-step embryo transfer（２段階胚移植法）”のプロトコール
| 報告者 （報告年） |
移植胚数 | 移植周期数 | 臨床妊娠率 （％） |
多胎妊娠率 （％） |
|
| Day 2 | Ｄａｙ 5 | ||||
| Jonse et al. (1998) Jones et al. (1998) Gardner et al (1998) Gardner et al (1998) Milki et al. (1999) Milki et al. (1999) two-step embryo transfer |
０ ０ ０ ０ ０ ０ ２ |
３ ２ ３ ２ ３ ２ １ |
２９ １９ １５ ２５ ２４ ２９ ７５ |
４８.３ ３６.８ ８７ ６８ ７５.０ ７５.９ ６６.７ |
３５.７＊ １４.３＊ ３９＊＊ ５３＊＊ ６１.１＊ ３１.８＊ ２６ |
＊ 多胎妊娠数／臨床妊娠数
＊＊多胎妊娠数／on-going数
| １． | 日本産科婦人科学会 平成11年倫理委員会・登録・調査小委員会報告．（平成１０年分の体外受精・胚移植等の臨床実施成績および平成１２年３月における登録施設名．日産婦誌 ２０００；５２：９６２－９８７ |
| ２． | 高倉賢二，後藤 栄，野田洋一．体外受精－胚移植（ＩＶＦ-ＥＴ），新女性医学体系弟１５巻「不妊・不育」（総編集：武谷雄二；編集：青野敏博，麻生武志，中野仁雄，野澤志朗；担当編集：吉村泰典），東京：中山書店，１９９８；２９９－３１１ |
| ３． | 高倉賢二，野田洋一．妊娠の成立．加藤宏一監修 産科婦人科学，東京：へるす出版，１９９９；３４－５２ |
| ４． | 和久田晃司，高倉賢二，喜多伸幸，他．マウス卵管内胚の存在が子宮内膜増殖能に及ばす影響．産婦の進歩 １９９６；４８：２５４－２５７ |
| ５． | 高倉賢二，和久田晃司，竹林浩一，他．胚による子宮内膜胚受容能の誘導．産婦治療 １９９９；７９：６１７ |
| ６． | Wakuda K, Takakura K, Nakanishi K, et al.Embryo-dependent induction of embryo receptivity in the mouse endometrium.J Reprod Fertil 1999;115:315-324 |
| ７． | 石川弘伸，高倉賢二，山出一郎，他．マウス子宮内膜間質細胞を用いたin vitro脱落膜化モデルの作成．産婦の進歩 １９９７；４９：１９３－２０４ |
| ８． | 石 紅，後藤 栄，廣瀬雅哉，他．In vitroマウス着床モデルによる脱落膜細胞・胚相互作用の解析．産婦の進歩 １９９８；５０：１８０－１９４ |
| ９． | Tang B, Gurpide E, Direct effect of gonadotropins on decidualization of human endometrial stromal cells. J Steroid Biochem Mol Biol 1993;47:115-121 |
| １０． | Tang B, Guller S, gurpide E.. Mechanism of human endometrial stromal cells decidualization. Ann NY Acad Sci 1994;734:19-25 |
| １１． | 笠原恭子，高倉賢二，竹林浩一，他．ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化過程における１７βエストラジオール，ポロゲステロン，hCGの役割．産婦の進歩２０００；５２：１２０－１３１ |
| １２． | Kasahara k, Takakura K, takebayashi K, et al. The role of human chorionic gonadotropin on decidualization of endometrial stromal cells in vitro. J Clin Endocrino Metab 2001;86:1281-1286 |
| １３． | American Society for Reproductive Medicine. Blastocyst production and transfer in clincal assisted reproduction. A practice committee report January 2001 |
| 以下省略 |